1. PCR kuantitatif Real-time
Pada tahun 1996, reaksi rantai polimerase kuantitatif real-time (qPCR Real-time) pertama kali diperkenalkan oleh biosystem yang diterapkan di Amerika Serikat. QPCR Real-time yang biasa disebut mengacu pada tambahan kelompok neon ke reaksi PCR untuk terus memantau sinyal neon. Urutan penampilan dan perubahan kekuatan sinyal dapat digunakan untuk menganalisis jumlah awal gen target secara waktu nyata. Penemuan teknologi ini mewujudkan lompatan dari kualitatif ke PCR kuantitatif.
2. Bahan kimia yang digunakan dalam fluoresensi PCR
Saat ini, qPCR Real-time dibagi menjadi dua kategori: pewarna neon dan probe neon sesuai dengan berbagai bahan kimia neon yang digunakan.
3. Pewarna yang digunakan dalam fluoresensi PCR
Pewarna berpendar juga disebut dengan pewarna mengikat DNA. Molekul pewarna utama yang saat ini digunakan adalah SYBR Green I. SYBR Green saya secara khusus dapat mengikat alur kecil DNA yang terjalin. Free SYBR Green saya hampir tidak memiliki sinyal neon, tetapi mentautkan ke DNA double-stranded. Setelah itu, sinyal fluoresensi dapat ditingkatkan sebesar ratusan kali. Dengan meningkatnya Produk PCR, jumlah pengikat produk dan pewarna PCR juga meningkat, dan intensitas sinyal fluoresensi mewakili jumlah molekul DNA beruntai ganda.
Keuntungan dari pewarna neon adalah bahwa mereka mudah digunakan, dapat dikombinasikan dengan Produk PCR apa pun, dan murah.
Secara umum, metode SYBR Green I adalah salah satu eksperimen qPCR Real time yang paling dasar dan umum digunakan.
4. Probe untuk PCR fluoresensi
Probe neon yang paling umum digunakan dalam qPCR Waktu Nyata adalah probe TaqMan. Prinsip dasar adalah mendesain dan mensinkronkan probe yang dapat memberikan hybridize pada gen target. Ujung 5 'probe dilabeli dengan fluorofore, dan ujung 3' dilabeli dengan grup quencher.
Dalam keadaan normal, jarak spasial antara kedua kelompok sangat dekat, dan gen neon tidak dapat fluoresce karena pendinginan. Selama amplifikasi PCR, primer dan probe mentautkannya kepada templat pada saat yang bersamaan, dan posisi pengikatan dari probe terletak antara utama hulu dan hilir.
Ketika amplifikasi berkembang ke posisi di mana probe mentautkan, enzim Taq menggunakan aktivitas exonuklease 5 'untuk menghapus molekul neon yang menempel pada ujung 5' probe dari probe, menyebabkan ke fluoresce. Jumlah molekul neon yang terdeteksi berbanding lurus dengan jumlah Produk PCR, oleh karena itu, jumlah templat DNA awal dapat dihitung sesuai dengan intensitas fluoresensi dalam sistem reaksi PCR.
Teknologi probe TaqMan mengatasi masalah kombinasi pewarna neon dan amplifikasi non-spesifik. Setelah reaksi, tidak perlu mencair deteksi kurva, yang akan mempersingkat waktu uji.
Keuntungan dari teknologi probe TaqMan adalah latar belakang fluoresensi rendah, sensitivitas tinggi, stabilitas hibridasi tinggi, resolusi spectral fluoresensi baik, dan kekhususan tinggi.
Karena kekhususan TaqMan yang tinggi, produk ini dapat digunakan untuk penderita allelic, terutama untuk polimorpsms gen manusia dan untuk membedakan dan menghitung berdasarkan SNP.
Email kami: