Berita

1. PCR kuantitatif Real-time

Pada tahun 1996, reaksi rantai polimerase kuantitatif real-time (qPCR Real-time) pertama kali diperkenalkan oleh biosystem yang diterapkan di Amerika Serikat. QPCR Real-time yang biasa disebut mengacu pada tambahan kelompok neon ke reaksi PCR untuk terus memantau sinyal neon. Urutan penampilan dan perubahan kekuatan sinyal dapat digunakan untuk menganalisis jumlah awal gen target secara waktu nyata. Penemuan teknologi ini mewujudkan lompatan dari kualitatif ke PCR kuantitatif.

2. Bahan kimia yang digunakan dalam fluoresensi PCR

Saat ini, qPCR Real-time dibagi menjadi dua kategori: pewarna neon dan probe neon sesuai dengan berbagai bahan kimia neon yang digunakan.

3. Pewarna yang digunakan dalam fluoresensi PCR

Pewarna berpendar juga disebut dengan pewarna mengikat DNA. Molekul pewarna utama yang saat ini digunakan adalah SYBR Green I. SYBR Green saya secara khusus dapat mengikat alur kecil DNA yang terjalin. Free SYBR Green saya hampir tidak memiliki sinyal neon, tetapi mentautkan ke DNA double-stranded. Setelah itu, sinyal fluoresensi dapat ditingkatkan sebesar ratusan kali. Dengan meningkatnya Produk PCR, jumlah pengikat produk dan pewarna PCR juga meningkat, dan intensitas sinyal fluoresensi mewakili jumlah molekul DNA beruntai ganda.

Keuntungan dari pewarna neon adalah bahwa mereka mudah digunakan, dapat dikombinasikan dengan Produk PCR apa pun, dan murah.

Secara umum, metode SYBR Green I adalah salah satu eksperimen qPCR Real time yang paling dasar dan umum digunakan.

4. Probe untuk PCR fluoresensi

The most commonly used fluorescent probes in Real-time qPCR are TaqMan probes. The basic principle is to design and synthesize a probe that can specifically hybridize to the target gene. The 5' end of the probe is labeled with a fluorophore, and the 3' end is labeled with a quencher group.

Dalam keadaan normal, jarak spasial antara kedua kelompok sangat dekat, dan gen neon tidak dapat fluoresce karena pendinginan. Selama amplifikasi PCR, primer dan probe mentautkannya kepada templat pada saat yang bersamaan, dan posisi pengikatan dari probe terletak antara utama hulu dan hilir.

When the amplification extends to the position where the probe binds, the Taq enzyme uses the 5' exonuclease activity to cleave the fluorescent molecule attached to the 5' end of the probe from the probe, causing it to fluoresce. The number of detected fluorescent molecules is proportional to the number of PCR products, therefore, the number of initial DNA templates can be calculated according to the fluorescence intensity in the PCR reaction system.

Teknologi probe TaqMan mengatasi masalah kombinasi pewarna neon dan amplifikasi non-spesifik. Setelah reaksi, tidak perlu mencair deteksi kurva, yang akan mempersingkat waktu uji.

Keuntungan dari teknologi probe TaqMan adalah latar belakang fluoresensi rendah, sensitivitas tinggi, stabilitas hibridasi tinggi, resolusi spectral fluoresensi baik, dan kekhususan tinggi.

Karena kekhususan TaqMan yang tinggi, produk ini dapat digunakan untuk penderita allelic, terutama untuk polimorpsms gen manusia dan untuk membedakan dan menghitung berdasarkan SNP.